Este artigo analisa a atuação da Agência Nacional de Saúde Suplementar (ANS) na regulação assistencial do setor entre 2000 e 2018. Por meio de análise documental, caracterizaram-se as principais iniciativas dessa dimensão regulatória nos cinco mandatos da diretoria da ANS no período. Ademais, o estudo explora as normas legais e infralegais relacionadas ao tema e as principais ações da ANS para a garantia das coberturas e a qualificação da assistência ofertada por operadoras e prestadores de serviços. Essas normativas foram organizadas em três eixos de regulação assistencial: rol de procedimentos e eventos em saúde e cobertura assistencial; segmentação assistencial; e iniciativas de promoção à saúde, prevenção de doenças e qualificação da assistência. Observa-se que as medidas de regulação assistencial implementadas seguiram uma tendência de continuidade, em que pese a variação de orientações políticas e trajetórias profissionais de seus diretores-presidentes ou a configuração da diretoria colegiada. Isso pode ser atribuído a fatores como a profissionalização da regulação e o estabelecimento do arcabouço institucional da ANS. Apesar do caráter microrregulatório da atuação da agência, a regulação assistencial contribuiu para a promoção da atenção integral aos beneficiários de planos de saúde e para a indução de melhores práticas assistenciais pelas operadoras e seus prestadores de serviços. Porém, persistem pressões do empresariado para a flexibilização da regulação assistencial.