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O objetivo foi analisar o conhecimento sobre a higiene das mãos dos profissionais do Sistema de Saúde Andaluz (Espanha). Os inquéritos foram realizados em 2011, por meio do questionário Hand Hygiene Knowledge Questionnaire for Health-Care Workers, usando a técnica da análise de classe latente. Questões com porcentagens mais baixas de acertos são as relacionadas com a prevenção da transmissão de micro-organismos após exposição ao paciente por higiene das mãos e aquelas relacionadas com a utilização de preparações à base de álcool. Obtivemos um modelo de sete classes latentes. Principais diferenças sociodemográficas: os profissionais de conhecimentos mais baixos são homens, jovens e profissionais não relacionados à saúde; ter recebido treinamento anterior e não discriminar as pessoas com grande conhecimento. Concluímos que é necessária a revisão dos programas de formação de higiene das mãos para melhorar o conhecimento sobre aspectos conceituais da transmissão de micro-organismos pelas mãos.